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            【細胞治療原創文章】病毒載體選擇之下游工藝的差異及挑戰


            在上一期的文章中,我們初步探討了不同病毒載體在上游工藝中的差異性,這些差異對于病毒載體的選擇和生產成本均有不同程度的影響。那么,不同的病毒載體在下游工藝過程中是否也存在一定的差異性呢?這些差異性又會對CAR-T生產帶來什么樣的影響呢?


             從不同的工藝路線中可以看出,病毒載體在下游工藝中的差異性主要是下游處理過程中各個工藝單元的組合不同。同時,這些不同的工藝都需要面對相同的挑戰,即病毒載體活性的維持、雜質的去除、病毒載體的回收率。我們不妨從這三個方面對不同的病毒載體在下游工藝中的差異和挑戰進行簡單的探討。

            -01-

            病毒載體的活性維持

                   病毒載體在生產過程中會出現活性逐漸下降的情況。這個過程與病毒載體所處環境的理化狀態密切相關。病毒載體所處的理化狀態對于病毒載體活性的影響主要來自于溫度、pH。不同緩沖液pH、不同儲存溫度,在不同條件下的病毒載體可以表現出不同的穩定性,這是由于不同病毒載體本身的結構不同導致的。更進一步的分析表明,病毒載體的穩定性與病毒載體生產用細胞所能提供的固醇類物質水平和細胞膜結構密切相關(Beer et al., 2003)。


             在另一項研究中發現,VSV-G包膜在穩定性上要優于GALV包膜(Carmo et al., 2006)。而VSV-G包膜常用于商業化的慢病毒載體,GALV包膜多應用于商業化的逆轉錄病毒載體,這也就意味著慢病毒載體在本身結構上要比逆轉錄病毒載體更穩定一些。因此,VSV-G包膜的慢病毒載體比GALV的逆轉錄病毒載體理論上可耐受更多步驟和更長時間的處理。


            -02-

            雜質的去除

             病毒載體的下游工藝過程中需要去除的雜質種類較多。以慢病毒載體為例,雜質類型可分為產品相關雜質(例如:無感染性的病毒載體顆粒)和工藝相關雜質(例如:血清蛋白)(Ruscic et al., 2019)。這些雜質的去除主要基于病毒載體與雜質的顆粒大小、尺寸差異以及病毒載體與雜質帶的電荷差異。常見的工藝單元為離心、膜過濾、核酸酶處理、分子篩層析、陰離子交換層析、切向流超濾等?;谏鲜龉に噯卧⒌牟煌M合,可以將總DNA去除率控制在99.1%至99.84%,總蛋白去除率控制在99.85%至99.9%,宿主細胞DNA去除率控制在99.8%,宿主蛋白去除率控制在99.4%(Schweizer & Merten, 2010)。


            慢病毒載體下游處理過程中,雜質含量隨著工藝步驟的延伸而逐漸降低。其中,柱層析工藝是去除蛋白質雜質的主要步驟,過濾澄清和核酸酶處理是去除DNA的主要步驟,凝膠過濾是去除痕量雜質的主要步驟。

            商業化的逆轉錄病毒載體下游處理工藝多以膜過濾、離心、核酸酶處理為主。這些處理步驟不包括柱層析和凝膠過濾,因此不能有效去除雜質(《基因轉導與修飾系統藥學研究與評價技術指導原則(征求意見稿)》)。為了彌補逆轉錄病毒載體在包膜上的劣勢,通過采用VSV-G包膜和4070A 多嗜性包膜對逆轉錄病毒載體進行改造可以有效提高逆轉錄病毒載體的穩定性,進而可以采用經過優化的層析工藝進行柱層析處理(S. Coroadinha et al., 2010)。但上述研究目前還處于較早階段,并未真正應用于商業化逆轉錄病毒載體的生產過程中,因此,商業化的慢病毒載體的整體質量控制水平要優于目前商業化的逆轉錄病毒載體。



            -03-

            病毒載體的回收率

             病毒載體在下游工藝去除雜質的過程中,膜過濾的截留作用、pH的改變、鹽離子強度的升高、剪切力等原因造成病毒載體活性的下降和病毒載體顆粒的丟失,兩者都會帶來病毒載體回收的挑戰。在Mercedes Segura等人的研究中,對比了在相似工藝條件下,慢病毒載體和逆轉錄病毒載體之間的回收率差異。通過比較,Mercedes Segura等人發現,在相似工藝條件下,VSV-G包膜慢病毒載體回收率均比逆轉錄病毒載體要高。同時,由于病毒載體下游工藝步驟較多,即便每個步驟只有一點損失,最終也會導致回收率較低,因此,病毒載體整體下游工藝的回收率在30%左右也被認為是可以接受的。(Mercedes Segura et al., 2006)

             但是,逆轉錄病毒載體的回收率就一定低于慢病毒載體嗎?答案是:不一定。

             科學家們認為,商業化的逆轉錄病毒載體所用的GALV包膜在下游工藝處理過程中不穩定會導致逆轉錄病毒載體的損失量高于慢病毒載體,因此,逆轉錄病毒通常被認為“不可純化”(Boudeffa et al., 2019)。此時,商業化的逆轉錄病毒載體通常只會采用離心或膜過濾方法初步分離細胞碎片或宿主細胞等大尺寸雜質,由于工藝步驟的減少,實際的商業化逆轉錄病毒載體的回收率相對慢病毒載體要更高。

             綜合上述幾點,我們不難看出,由于慢病毒載體和逆轉錄病毒載體在使用的包膜穩定性上的差異,慢病毒載體的下游工藝可采用膜過濾、核酸酶處理、柱層析、超濾濃縮等多種工藝單元進行組合,而逆轉錄病毒載體的下游工藝多采用簡單的離心或膜過濾的方法進行處理。由于慢病毒載體的下游工藝步驟復雜,回收率較低,導致工藝運行成本較高。逆轉錄病毒載體的下游工藝簡單,各步驟回收率較高,因此工藝運行成本較低。雖然慢病毒載體的下游工藝回收率要低于逆轉錄病毒載體,但是慢病毒載體在下游處理過程中可以去除更多的雜質,因此純度更好,安全性更高。隨著資源的投入和技術的發展,逆轉錄病毒載體的柱層析工藝也正在研究過程中,相信隨著時間的推移,逆轉錄病毒載體的回收率和質量水平也會有進一步提高。


            Reference

            1.       國家藥品監督管理局審評中心《基因轉導與修飾系統藥學研究與評價技術指導原則(征求意見稿)》.pdf. (n.d.).

            2.       Beer, C., Meyer, A., Müller, K., & Wirth, M. (2003). The temperature stability of mouse retroviruses depends on the cholesterol levels of viral lipid shell and cellular plasma membrane. In Virology (Vol. 308, Issue 1, pp. 137–146). https://doi.org/10.1016/S0042-6822(02)00087-9

            3.       Boudeffa, D., Bertin, B., Biek, A., Mormin, M., Leseigneur, F., Galy, A., & Merten, O. W. (2019). Toward a scalable purification protocol of GaLV-TR-pseudotyped lentiviral vectors. Human Gene Therapy Methods, 30(5), 153–171. https://doi.org/10.1089/hgtb.2019.076

            4.       Carmo, M., Faria, T. Q., Falk, H., Coroadinha, A. S., Teixeira, M., Merten, O. W., Gény-Fiamma, C., Alves, P. M., Danos, O., Panet, A., Carrondo, M. J. T., & Cruz, P. E. (2006). Relationship between retroviral vector membrane and vector stability. In Journal of General Virology (Vol. 87, Issue 5, pp. 1349–1356). https://doi.org/10.1099/vir.0.81302-0

            5.       de las Mercedes Segura, M., Kamen, A., & Garnier, A. (2006). Downstream processing of oncoretroviral and lentiviral gene therapy vectors. Biotechnology Advances, 24(3), 321–337. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2005.12.001

            6.       Merten, O. W., Hebben, M., & Bovolenta, C. (2016). Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development, 3(December 2015), 16017. https://doi.org/10.1038/mtm.2016.17

            7.       Ruscic, J., Perry, C., Mukhopadhyay, T., Takeuchi, Y., & Bracewell, D. G. (2019). Lentiviral Vector Purification Using Nanofiber Ion-Exchange Chromatography. In Molecular Therapy - Methods and Clinical Development (Vol. 15, pp. 52–62). https://doi.org/10.1016/j.omtm.2019.08.007

            8.       S. Coroadinha, A., Gama-Norton, L., I. Amaral, A., Hauser, H., M. Alves, P., & E. Cruz, P. (2010). Production of Retroviral Vectors: Review. Current Gene Therapy, 10(6), 456–473. https://doi.org/10.2174/156652310793797739

            9.       Schweizer, M., & Merten, O.-W. (2010). Large-Scale Production Means for the Manufacturing of Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy, 10(6), 474–486. https://doi.org/10.2174/156652310793797748


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